La plataforma modular automatizada de cultivo de células microfluídicas reduce el estrés glucolítico en los organoides de la corteza cerebral

Sep 06, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20173 (2022) Citar este artículo

3640 Accesos

3 citas

125 Altmetric

Detalles de métricas

Los sistemas de órgano en un chip combinan microfluidos, biología celular e ingeniería de tejidos para cultivar modelos in vitro específicos de órganos en 3D que recapitulan la biología y fisiología de sus contrapartes in vivo. Aquí, hemos desarrollado una plataforma multiplex que automatiza el cultivo de organoides individuales en microentornos aislados a velocidades de flujo de medios definidas por el usuario. Los flujos de trabajo programables permiten el uso de múltiples depósitos de reactivos que pueden aplicarse para diferenciar directamente, estudiar variables temporales y cultivar cultivos a largo plazo. Aquí se describen técnicas novedosas en la fabricación de chips de polidimetilsiloxano (PDMS) que permiten características en los planos superior e inferior de un solo sustrato de PDMS. El análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) de cultivos de organoides de corteza cerebral automatizados muestra beneficios en la reducción del estrés glucolítico y del retículo endoplasmático en comparación con los cultivos celulares in vitro convencionales.

El cultivo celular ha sido un modelo principal para estudiar la enfermedad y el desarrollo humanos durante más de 70 años desde el aislamiento de células HeLa de una biopsia de cáncer de cuello uterino humano1,2. Utilizados originalmente como un vehículo para investigar virus, los protocolos de cultivo de células humanas se optimizaron para un crecimiento rápido y fácil para producir grandes cantidades de material. Si bien los protocolos de cultivo de tejidos han avanzado, particularmente en la reducción de muchos componentes de los medios, muchas de estas recetas originales siguen vigentes. Todavía hay mucho espacio para mejorar los protocolos de cultivo de tejidos para imitar las concentraciones, el suministro y la eliminación de nutrientes fisiológicos. La microfluídica automatizada nos permite ir más allá de los protocolos tradicionales mediante la alimentación a tasas y precisión que no son factibles manualmente.

Los avances recientes en la biología de células madre y del desarrollo han generado modelos más precisos que se asemejan a aspectos del tejido humano primario3,4. Las células madre embrionarias humanas (hES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS), denominadas colectivamente células madre pluripotentes (PSC), tienen el potencial de diferenciarse en la mayoría de los tipos de células del cuerpo, y los protocolos aprovecharon esto para generar modelos de cultivo 3D. para tejidos humanos, incluidos cerebro, intestino, hígado y mama5,6. Estos cultivos celulares autoensamblados y específicos de órganos, denominados organoides, se utilizan ampliamente como modelos in vitro en la investigación del desarrollo, la patogenia y la medicina7,8,9. Los organoides imitan las características funcionales clave de la fisiología de su homólogo de tejido primario con mayor precisión que los cultivos de células 2D6. Más allá del uso como modelos in vitro, los organoides también se están explorando para aplicaciones en medicina regenerativa y atención médica como tejido para implantes5. A medida que la tecnología abre nuevas fronteras, existe una creciente necesidad de mejores métodos para cultivar, controlar y analizar cultivos de organoides. Existe la necesidad de disminuir la brecha entre los cultivos in vitro y el tejido primario. Esfuerzos como los avances que se muestran aquí aprovechan los microfluidos de precisión, la automatización robótica y la detección sin contacto para permitir un cultivo celular robusto y reproducible optimizado para la fidelidad del tejido.

La capacidad de los organoides derivados de PSC para autoensamblarse y generar muchos tipos de células específicas de tejido los hace particularmente útiles para modelar tejidos y sistemas complejos. El cerebro contiene una de las complejidades más altas del cuerpo humano, y los investigadores pueden generar modelos de alta calidad de diferentes regiones del cerebro con tecnología de organoides. Los organoides cerebrales son una forma de organoides cerebrales que modelan la fisiología de la corteza cerebral y contienen muchos tipos de células y subregiones específicas de la corteza10. Estos organoides se utilizan ampliamente para la investigación sobre el desarrollo cerebral prenatal11,12,13, patologías cerebrales14 y pruebas terapéuticas15. Los organoides cerebrales crecerán hasta unos pocos milímetros de diámetro durante un cultivo prolongado y pueden mantenerse en cultivo indefinidamente16.

La Figura 1 ilustra el proceso de generación de organoides cerebrales humanos mediante la agregación de PSC17,18 humanos. La inducción neural se logra mediante la inhibición de las vías WNT (IWR1-\(\varepsilon\)) y Nodal/Activin (SB431542) y produce tejido cortical tanto dorsal como ventral. A medida que el desarrollo de los organoides avanza a un ritmo similar al del desarrollo fetal primario, estos cultivos deben mantenerse durante semanas o meses para observar los tipos de células y las estructuras tisulares en etapa tardía. Estos incluyen tipos de células diferenciadas terminalmente, como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y la observación de rosetas organizadas localmente compuestas de células madre neurales de la glía radial (Fig. 1B). Los protocolos actuales de organoides cerebrales tienen limitaciones en el rendimiento, la consistencia y la confiabilidad, así como problemas de salud, que muestran signos distintivos de estrés celular19,20. Es probable que el fenotipo del estrés celular sea multifactorial; sin embargo, muchos factores pueden resultar del cultivo celular tradicional. El ritmo de los cambios manuales de medios (a menudo una vez cada 1 a 3 días) conduce a cambios erráticos en la disponibilidad de nutrientes y la acumulación de metabolitos tóxicos. Al alimentarse fuera de la incubadora, las células experimentan temperaturas más frías y una reducción del dióxido de carbono disuelto, lo que conduce a un entorno más alcalino. La automatización de laboratorio es cada vez más frecuente en las ciencias de la vida para reducir el efecto de estas variables no controladas y aumentar la cantidad y calidad de los experimentos, lo que permite un fácil mantenimiento a largo plazo con requisitos manuales mínimos.

Descripción general del protocolo de generación de organoide cerebral humano. (A) Las células madre pluripotentes humanas se expanden en cultivo 2D tradicional, se disocian, se agregan en micropocillos y se maduran en cultivos organoides 3D utilizando condiciones de medios definidas para promover la diferenciación del tejido de la corteza cerebral. En este estudio, el día 12 posterior a la agregación, los organoides se mantuvieron en suspensión y se mantuvieron manualmente (flecha negra) o se transfirieron a pocillos individuales de un chip de microfluidos y se mantuvieron en automatización (flecha azul). (B) Imágenes de cultivos de organoides cerebrales. Las imágenes de campo claro con un aumento bajo (izquierda) y alto (centro) en condiciones de cultivo estándar muestran la morfología y la heterogeneidad de los organoides. Tinciones de inmunofluorescencia en la semana 5 para PAX6 (células progenitoras de la glía radial, verdes), CTIP2 (BCL11B) (neuronas de proyección excitatorias, magenta), ZO-1 (TJP1) (proteínas de unión estrecha blancas en los extremos de la glía radial, superficie apical de la neurona). tubo), muestran estructuras de roseta similares a zonas ventriculares características con glía radial rodeada de neuronas. Núcleos teñidos con DAPI (azul). (C) Imagen del chip de microfluidos PDMS. El chip de cultivo celular personalizado, modelado a partir de una placa estándar de 24 pocillos, alberga organoides para experimentos automatizados.

En el cultivo celular convencional, la dispensación, el movimiento y la eliminación de líquido son las acciones necesarias requeridas en todos los protocolos. Por lo tanto, el manejo de líquidos y el almacenamiento adecuado de reactivos líquidos son características clave para automatizar este proceso. Las tecnologías actuales de manejo de líquidos se clasifican en términos generales en dos categorías: flujo continuo y microfluídica digital21. Los sistemas de flujo continuo se basan en el flujo de líquido en estado estable generado por bombas de presión, mecánicas o electrocinéticas. Con flujo constante, estos sistemas entregan un alto control de velocidad y homogeneidad; sin embargo, son menos flexibles para manipulaciones fluídicas complejas y difíciles de escalar. Los sistemas de canales cerrados derivados del flujo continuo son intrínsecamente de difícil acceso, requieren el manejo de gases atrapados y no escalan bien porque los parámetros que gobiernan el flujo en cualquier ubicación individual dependen de las propiedades del sistema completo.

Por el contrario, los microfluidos basados ​​en gotitas o de flujo segmentado controlan volúmenes discretos, lo cual es conveniente para la manipulación de gotitas22, la mezcla, la encapsulación, la clasificación, la detección y los experimentos de alto rendimiento23. En combinación con las válvulas, la microfluídica basada en gotitas puede realizar la mayoría de las operaciones lógicas en las gotitas para clasificarlas, fusionarlas y dividirlas. El polidimetilsiloxano (PDMS) es el material más común para fabricar dispositivos de microfluidos debido a su bajo costo, versatilidad en la creación de prototipos y alta permeabilidad a los gases24. La microfluídica basada en gotas ha creado muchas oportunidades de control que son imposibles o poco prácticas en la práctica manual, como programar la frecuencia de alimentación. Dentro de ambas tecnologías, existen variedades de enfoques con y sin contacto25. Los manipuladores de líquidos de contacto requieren una punta que contenga líquido para alcanzar el sustrato, similar al pipeteo pero con mayor precisión y control. Los manipuladores de líquidos sin contacto manipulan las presiones y velocidades de los fluidos para controlar el flujo. Ambas tecnologías han avanzado a volúmenes ultrabajos (nanolitros) y caudales ultrabajos (microlitros por hora).

Los organoides se cultivan comúnmente en lotes con varios organoides suspendidos en pocillos individuales de una placa. Las condiciones compartidas en un solo pozo respaldan la consistencia del lote; sin embargo, al aumentar la cantidad de variables en un experimento, como uno con múltiples genotipos, el rendimiento se vuelve un desafío. Además, las placas de múltiples pocillos no son adecuadas para controlar las condiciones dinámicas ni generar gradientes de concentración en los medios. Por el contrario, los chips de microfluidos como cámaras de cultivo de organoides permiten un control preciso de las condiciones ambientales con una alta resolución espaciotemporal26,27. Las diluciones en serie pueden lograr gradientes automatizados y el flujo volumétrico robótico puede administrar de manera eficiente experimentos de alto rendimiento. La elección del dispositivo para la automatización del laboratorio debe considerar el uso, la flexibilidad y el costo. Teniendo en cuenta el microentorno del cultivo celular, un sistema sin contacto similar al desarrollado aquí ofrece ventajas clave para mantener la homeostasis de las concentraciones de nutrientes, reducir la acumulación de subproductos metabólicos y generar fuerzas de corte más similares a las condiciones in vivo.

Aquí desarrollamos una plataforma de microfluidos sin contacto basada en PDMS con alimentación segmentada para automatizar el cultivo celular prolongado. La plataforma se puede configurar para muchos protocolos de organoides y ensayos de gradiente. La interfaz de la plataforma permite la integración con otros instrumentos de investigación, como un sistema de imágenes en incubadora a través de Internet de las cosas. Evaluamos esta plataforma probando su capacidad para apoyar el crecimiento y desarrollo de organoides de la corteza cerebral humana.

Desarrollamos una plataforma de cultivo celular microfluídico automatizada para optimizar el crecimiento de organoides en 3D, la plataforma "Autocultivo". El sistema consta de seis módulos vinculados (Fig. 2): (1) Refrigerador con depósitos de reactivos (p. ej., medios frescos), (2) Bomba de jeringa, válvulas de distribución e interfaz de control, (3) depósitos de recolección de medios acondicionados en almacenamiento en frío , (4) un bus serial microfluídico que interactúa con una incubadora de cultivo celular y (5) un chip organoide microfluídico multiplexado que (6) inmoviliza organoides dentro de su recipiente de microambiente (1 de 24 pocillos). Para alimentar los organoides, cada pozo individual es atendido por un controlador fluídico; el controlador elimina los medios gastados a través de la aspiración a un colector en almacenamiento en frío y luego repone el recipiente con medios frescos a intervalos programables.

Cada uno de los 24 pozos de este sistema es un experimento aislado e independiente con un tubo de entrada, un tubo de salida y un depósito de recolección dedicados. El programa de alimentación de cada pozo es totalmente personalizable en cuanto a tasa y medios para aumentar la flexibilidad de la experimentación. Se puede programar un rango de alícuotas de 5 a 1000 \(\upmu \hbox {L}\) de 3 depósitos de medios/reactivos para cualquier pozo. Los depósitos de medios/reactivos también se pueden usar en combinación. Por diseño, cada pozo forma un circuito fluídico que mantiene el aislamiento de los otros circuitos en la placa (ver "Métodos"). Una placa completa de 24 pocillos se repara en 72 segundos, y el tiempo entre inyecciones de fluido puede ser mayor (por ejemplo, cada hora, dos veces al día, cada dos días, etc.). Los medios acondicionados se pueden recuperar para el análisis molecular sin interrumpir el cultivo en ningún momento durante o después del experimento. Los medios acondicionados que se toman para la recolección están separados de los cultivos por una fase de aire en los canales fluídicos de salida para mitigar el riesgo de infección que puede ocurrir debido al medio inactivo en las líneas. Después del experimento, los organoides se recuperan para el análisis molecular.

Diseño e implementación de la plataforma de cultivo microfluídico automatizado. (A) Ilustración de la plataforma de cultivo de organoides microfluídicos automatizada, Autoculture. (B) Imágenes de la vista frontal del Autocultivo. (1) Refrigerador con depósitos de reactivos. (2) Bomba de jeringa, válvulas de distribución e interfaz de control. (3) Refrigerador con depósitos de recolección de medios acondicionados. Estos componentes residen en una mesa de laboratorio directamente encima de la incubadora de cultivo celular. (4) Los tubos de microfluidos ingresan a través de un puerto de incubadora y se conectan al (5) chip de la placa de pocillos de microfluidos dentro de la incubadora. (6) Diagrama de sección transversal de un solo pocillo que contiene un cultivo organoide.

Con estos parámetros de control, las placas enteras pueden realizar el mismo flujo de trabajo para generar lotes uniformes de organoides. También se puede valorar un reactivo con un gradiente incremental de concentración del pocillo 1 al 24. Además, se pueden ejecutar múltiples protocolos/programas de alimentación en la placa y cambiar los componentes del medio o los programas de alimentación en varios puntos de tiempo a lo largo de un experimento.

El Internet de las cosas (IoT) de Amazon Web Services (AWS) proporciona un marco de control conveniente para que múltiples dispositivos comuniquen información e inicien acciones. Con un protocolo de comunicación como Message Queuing Telemetry Transport (MQTT), los sistemas pueden administrar esfuerzos sincronizados y coordinados de control y adquisición de datos en tiempo real a través de Internet28. La comunicación de sistema a sistema se produce a través de una red de área local (LAN), mientras que los investigadores pueden realizar llamadas bajo demanda para obtener datos o acciones de forma remota. Como tal, la arquitectura de software de Autoculture tiene control desde la nube de AWS para diseñar, iniciar, pausar, editar y detener experimentos a pedido (Fig. 3).

Integración de IoT Cloud: una interfaz gráfica de usuario alojada en Internet transmite mensajes a la plataforma Autoculture a través de MQTT para iniciar, monitorear y finalizar experimentos.

El módulo de cómputo Raspberry Pi se usó para ejecutar experimentos localmente y aceptar comandos transmitidos a través de MQTT. La interfaz del programa de aplicación (API) utilizada para enviar comandos en serie a la bomba y las válvulas Tecan se adaptó de un paquete Python de código abierto29. Los protocolos para llevar a cabo los experimentos se desarrollaron mediante secuencias cronometradas de acciones unitarias a la bomba y las válvulas. Como usuario, los parámetros y rangos disponibles para construir experimentos automatizados se enumeran en la Tabla 1. En esta arquitectura, la conexión IoT brinda la accesibilidad para operar experimentos de forma remota, mientras que los horarios operados localmente en el dispositivo brindan la seguridad de operación en el caso de Internet inestable conexión.

La figura 4 describe el proceso de fabricación y ensamblaje del chip microfluídico PDMS. El chip microfluídico de vidrio PDMS ópticamente transparente tiene el tamaño de una placa de 24 pocillos (85,5 mm × 127,6 mm) para integrarse con herramientas de laboratorio como microscopios, lectores de placas y dispensadores robóticos. Los 24 pocillos aislados se pueden direccionar a través de canales cuadrados de 2 mm en la interfaz vidrio-PDMS. Para una accesibilidad conveniente, todas las entradas están ubicadas en una fila en el borde de la cara del chip y todas las salidas están ubicadas en una fila en el borde opuesto. El diseño de microfluidos de circuito abierto aquí contiene pozos que están abiertos al aire. De esta manera, las burbujas acumuladas en el sistema se agotan, hay libre intercambio de gases con el entorno de la incubadora y se puede acceder fácilmente a los organoides durante la carga del chip y la conclusión experimental. Cada pozo atrapa 120 \(\upmu \hbox {L}\) que pueden usarse como un microambiente, incluido el uso de andamios extracelulares. La entrada y la salida de los canales fluídicos están 5 mm por encima del fondo del pozo, lo que ayuda a mitigar el riesgo de perder una muestra no adherente en el canal de salida.

Fabricación del chip microfluídico PDMS. (A) Representación gráfica del patrón de molde entrelazado para el sustrato PDMS en el ensamblaje del chip microfluídico. (B) Los montajes entrelazados (azul, rojo y verde) se adhieren al molde base (púrpura) y definen geometrías microfluídicas sobre el PDMS vertido que se retienen a medida que se cura el sustrato. (C) El sustrato PDMS se retira del molde y se une al vidrio. (D) Una representación de la sección transversal del chip. El fluido entra por entradas microfluídicas en la superficie y sigue canales sellados con vidrio en la parte inferior hasta pozos con acceso abierto desde la parte superior. (E) Una placa de interfaz fluídica impresa en 3D (amarilla) conecta 24 líneas de microtubos fluídicos con las entradas/salidas del chip microfluídico. (F) Chip microfluídico (centro) con un ejemplo de la placa de interfaz fluídica (izquierda) y la placa de interfaz fluídica completamente instalada (derecha).

Cada placa de interfaz fluídica impresa en 3D conecta simultáneamente 24 líneas (Fig. 4F). Esta es una simplificación en comparación con la inserción de cada línea individualmente, lo cual es común para los microfluidos basados ​​en PDMS. Dentro de los insertos de tubo de la placa de interfaz fluídica, tres púas circulares sellan el tubo Tygon con proyecciones rígidas. Las proyecciones rígidas que llevan los tubos se alinean con los orificios de acceso al canal del chip microfluídico. Cuando la colección de 24 líneas se acopla con los orificios moldeados en el PDMS, se forman sellos de orificio con todas las proyecciones de la placa y las líneas de tubería de la plataforma se alinean con los canales del chip de microfluidos.

En el día 12 de desarrollo, los cultivos de organoides cerebrales se transfirieron desde agitadores orbitales (Fig. 5A) a pocillos de microfluidos automatizados (Fig. 5B). El agitador orbital mantiene un régimen de velocidad casi constante de aproximadamente 0,12 m/s30,31,32. Realizamos una simulación de dinámica de fluidos computacional (CFD) utilizando Comsol Multiphysics33 (Fig. 5C) que representa los primeros 2,2 s de inyección de medios en el pozo. El fluido ingresa por la entrada, 5 mm por encima del piso de vidrio, y entra al pozo a través de una pared inclinada. La simulación comienza con un dominio líquido de medios lleno hasta el nivel de los puertos de entrada/salida con un dominio de aire existente arriba. En la alimentación, el medio ingresa a la cavidad y genera una onda que avanza desde la entrada hasta la salida. El organoide, modelado como una esfera, fijado 5 mm por debajo de la interfaz aire-medio, no observa la mayor parte de la turbulencia generada. El sustrato inferior (vidrio) experimenta \(<5\%\) de la velocidad máxima durante la alimentación. Las velocidades en este régimen son instantáneas (a diferencia del estado casi estacionario) y dos órdenes de magnitud menores que las de los agitadores orbitales, lo que induce velocidades más bajas y menos esfuerzo cortante sobre el cultivo. Una de las ventajas de este sistema es que los investigadores pueden adaptar la tasa de flujo de medios y el programa de entrega para lograr una difusión óptima de los nutrientes con una interrupción mínima del organoide.

La dinámica de fluidos computacional simuló el flujo en los pocillos de cultivo de tejidos individuales utilizando el sistema automatizado. (A) Los cultivos de organoide se expanden en placas de pocillos giradas en un agitador orbital. (B) Después de 12 días, los organoides se trasplantan al pozo de microfluidos automatizado. (C) Un pozo del sistema automatizado propuesto con inyección de fluido constante durante 2 s con líneas de corriente de velocidad.

El crecimiento de organoides cerebrales en Autocultivo se comparó con el de condiciones de agitador orbital en un experimento de 18 días. Se agregaron células madre pluripotentes humanas para formar organoides y se mantuvieron en condiciones estándar durante los primeros 12 días durante la inducción neural (ver "Métodos"). Se dividió el lote y se cargaron 12 organoides en un chip de microfluidos Autoculture mientras que el resto se mantuvo en una placa de 6 pocillos en un agitador orbital como controles. Cada pocillo se cargó previamente con 50 \(\upmu \hbox {l}\) Matrigel inmediatamente antes de cargar los organoides para adherir cada organoide al centro del pocillo (ver "Métodos"). Los organoides automatizados se alimentaron con 70 \(\upmu \hbox {L}\) cada hora durante seis días, mientras que los controles se alimentaron con 2 ml cada dos días. En la automatización, no es necesario retirar periódicamente la placa de pocillos de la incubadora para la alimentación; por lo tanto, este sistema es muy adecuado para el seguimiento longitudinal del desarrollo de organoides. En este estudio, los organoides en la placa de pocillos de Autocultivo se monitorearon una vez por hora utilizando una plataforma de incubadora de imágenes de campo claro34,35.

La Figura 6A muestra la placa de cultivo de microfluidos automatizada dentro de una incubadora colocada en un sistema de imágenes automatizado de múltiples pocillos con control remoto y habilitado para IoT. El sistema de imagen fue diseñado para monitorear experimentos biológicos en un formato de placa de 24 pozos, usando una cámara dedicada para cada pozo. Para dar cuenta del desarrollo tridimensional de los organoides durante todo el experimento, capturamos ráfagas de imágenes, recorriendo el rango de distancias focales que cubren todo el tejido tridimensional. Se utilizó un algoritmo de visión por computadora para detectar las características enfocadas en cada plano focal, generar una imagen compuesta que maximiza las características enfocadas en todo el organoide y calcular el área proyectada. Este proceso se describe en trabajos anteriores35. La figura 6B muestra 12 cultivos de organoides de la corteza cerebral (día 12), cargados en pocillos individuales del chip de microfluidos y alimentados en paralelo en la plataforma Autoculture para el experimento. Las Figuras 6C,D muestran el crecimiento del "Cultivo 4" durante seis días sucesivos. Se observó un crecimiento robusto de organoides para los organoides en los pozos de Autocultivo y fue consistente con el aumento de tamaño observado para los organoides cultivados bajo condiciones de control. En comparación con los controles, los organoides automatizados desarrollaron un perímetro menos denso, lo que sugiere que la reducción de las velocidades y las fuerzas de corte pueden acomodar el crecimiento y la migración que, de lo contrario, se dividirían.

El día 18, los cultivos se recolectaron y analizaron mediante secuenciación de ARN a granel (RNA-seq) e inmunohistoquímica para evaluar los tipos de células generados en cada condición y la salud general de los cultivos celulares. Se compararon los transcriptomas de 7 organoides "Automatizados" y 4 "Suspensión". La expresión génica de marcadores de tipo celular para neuralepitelio (SOX2), células madre neurales de la glía radial (SOX2, HES5, PAX6, HOPX), progenitores intermedios (EOMES) y neuronas inmaduras (NeuroD1, RELN) no mostró diferencias consistentes entre el Autocultivo y muestras de control que sugieren que la fidelidad de la diferenciación general no se vio afectada por el uso del sistema Autoculture (Fig. 7A). De acuerdo con esto, vimos una expresión sólida de los marcadores de proteína progenitora neural, SOX2 y Nestin por inmunohistoquímica en secciones de organoides cultivados en condiciones estándar o de autocultivo (Fig. 7B).

Seguimiento longitudinal del desarrollo de organoides. (A) El chip de microfluidos Autoculture se encuentra en un sistema de imágenes automatizado de 24 pocillos con control remoto y habilitado para IoT. (B) Imágenes de campo brillante de doce cultivos individuales de corteza cerebral de 12 días de edad en el día 1 de alimentación automatizada. (C) Imágenes longitudinales de "Cultura 4" durante el experimento. (D) Expansión del área proyectada de "Cultura 4" durante el experimento. Esto se obtuvo utilizando un algoritmo de visión artificial34.

Al contrastar los organoides automatizados y de control, observamos una diferencia significativa en la expresión de genes asociados con el estrés del cultivo celular. Los estudios han demostrado que las vías de la glucólisis y el estrés del retículo endoplásmico (estrés ER) están reguladas al alza en los organoides en relación con las muestras de tejido in vivo, y esto se correlaciona con la especificación y maduración de subtipos de células deterioradas17,19. En este estudio, la glucólisis canónica fue la principal vía deferente con la gran mayoría de los genes importantes constantemente regulados a la baja (consulte las Tablas complementarias 2 y 3). Los genes que están notablemente regulados al alza en los organoides cerebrales mostraron niveles reducidos en la condición de automatización: ALDOA, ENO1, HK1 y PGK1 tuvieron cambios de -6.9, -10.4, -2.8 y -9.3, respectivamente (Fig. 7A). Además, los marcadores de estrés ER: ARCN1, GORASP2 y YIPF1 se redujeron en cambios de -2.8, -2.2 y -3.0, respectivamente. Consulte la Tabla complementaria 4 para obtener genes de estrés ER expresados ​​de manera más deferente.

Transcripción y resultados de imágenes inmunofluorescentes. (A) Comparaciones por pares de expresión para genes seleccionados asociados con la diferenciación neural, la glucólisis y el estrés ER. Los resultados fueron estadísticamente significativos con un valor de p ajustado ≤ 0,05, excepto para HOPX y NES de diferenciación neural. Los datos "automatizados" representan 7 réplicas biológicas y los datos de "suspensión" representan 4 réplicas biológicas con 6 réplicas técnicas (B) Las tinciones inmunofluorescentes para SOX2, Nestin y DAPI de las secciones de organoide en suspensión y automatizadas muestran marcadores progenitores congruentes.

Las crecientes demandas de experimentos a largo plazo, reproducibilidad, paralelización y análisis longitudinal impulsan el cultivo celular hacia la automatización. Este estudio muestra una solución microfluídica automatizada para el crecimiento y mantenimiento de organoides capaces de existir junto con otros dispositivos de control y detección a través de Internet de las cosas, lo que aumenta la capacidad de capitalizar la robótica de precisión para la experimentación automatizada. La combinación de esta plataforma con la plataforma de imágenes que se muestra aquí (Fig. 6) proporciona un entorno estacionario que permite de manera única el estudio en vivo de organoides individuales a lo largo del tiempo. Esta plataforma podría usarse fácilmente para mantener otros modelos de organoides y tejidos ex vivo. El chip de microfluidos de 24 plex descrito aquí también podría adaptarse para apoyar el crecimiento de cultivos adherentes (2D) al incluir un paso de protocolo adicional para tratar el chip de microfluidos con un revestimiento de superficie de adherencia celular antes de cargar las células.

El uso de agitadores orbitales para el cultivo de organoides a largo plazo ha sido ampliamente adoptado en el campo y brinda beneficios para la difusión de nutrientes y la homogeneidad del gas disuelto. Sin embargo, las velocidades del fluido y las fuerzas de cizallamiento presentes no se parecen al entorno embrionario. Los microfluidos, como en el sistema que se muestra aquí, podrían usarse para ajustar las velocidades de los fluidos, las fuerzas de cizallamiento y los gradientes de presión al tiempo que brindan los mismos beneficios para la concentración de nutrientes y gases disueltos a través de regímenes de alimentación rápidos. Nuestro sistema permite un entorno de bajas velocidades. La simulación CFD que se muestra aquí (Fig. 5) representa las condiciones presentes en el experimento de validación que seleccionó preferentemente para velocidades bajas; sin embargo, mayores tasas de profusión producirían gradientes de velocidad más altos que podrían usarse para estudiar los efectos sobre la morfología y diferenciación de los organoides.

La reducción de los niveles de estrés en los modelos de organoides cerebrales es crucial para lograr la relevancia fisiológica. Según lo medido por la expresión reducida de enzimas glucolíticas, el entorno de la plataforma de autocultivo da como resultado organoides de estrés reducido en comparación con las condiciones tradicionales de cultivo en suspensión. Las vías que responden a las condiciones ambientales, como el metabolismo del azúcar, el control de la hipoxia y la producción de proteínas, están interconectadas a través de la vía integrada de respuesta al estrés. Al reducir las fluctuaciones de concentración en los medios de cultivo celular a través de la alimentación automática, los cultivos pueden experimentar una mayor homeostasis. Se necesita más investigación para comprender los posibles efectos a largo plazo de la reducción de la expresión génica de la glucólisis y los genes de estrés ER y las condiciones ambientales críticas que subyacen a la firma de expresión génica asociada con menos estrés celular que observamos. Por ejemplo, no está claro si el agotamiento de nutrientes esenciales, como la glucosa, o la acumulación de metabolitos celulares, como la lactosa, es el factor crítico que lleva a la inducción de genes en la vía de la glucólisis observada en condiciones de cultivo de organoides estándar. Sin embargo, el sistema de autocultivo que desarrollamos aquí proporciona una plataforma en la que podemos explorar sistemáticamente esta pregunta.

Los medios de cultivo celular se almacenaron en depósitos de botellas de vidrio (Corning) con una tapa de suministro de solvente de puertos múltiples (Spex VapLock) y se almacenaron en \(4^{\circ }\hbox {C}\) durante la duración del experimento. Cada tapón de suministro del depósito contenía un único tubo de microcalibre Tygon de 0,030″ de DI × 0,090″ de DE (Masterflex), sellado con una tuerca de PTFE de dos piezas y un adaptador roscado de férula (Spex VapLock), que se extendía desde la parte inferior del depósito hasta un puerto de entrada en el cabezal de válvula de cerámica de 6 puertos de la bomba de jeringa (Tecan Cavro Centris, vial de vidrio de 1,0 ml). Se permite que el aire estéril rellene el depósito a través de un filtro de 0,22-\(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) colocado en la tapa para compensar las extracciones de reactivo de la bomba de jeringa. Se usaron los mismos adaptadores roscados de casquillo y tuerca de PTFE y tubería microbore de Tygon para conectar la bomba de jeringa a dos válvulas de distribución paralelas de 12 puertos (Tecan SmartValve). Cada tubo de microcalibre Tygon (Masterflex) de 0,020″ de DI × 0,060″ de DE que sale de la válvula de distribución se conecta a un solo pozo del chip de microfluidos. El aislamiento de fluidos entre los pozos se conserva a partir de esta unión. Cada válvula de distribución de 12 puertos da servicio a seis pozos en el chip de microfluidos. Se construyeron sistemas de dos y cuatro válvulas de distribución. La colección de tubos microbore de 2 m de largo se empaquetó en una trenza para un manejo conveniente y se guió a través del puerto de entrada posterior de una incubadora de cultivo celular estándar (Panasonic) (Fig. 2 (4)). En condiciones de incubadora (\(37^{\circ }\hbox {C}\), 5 % de CO2, 95 % de humedad relativa), una única placa de interfaz fluídica personalizada impresa en 3D se acopló al conjunto de tubos microbore para la administración de reactivos a las entradas del chip de microfluidos y una segunda placa de interfaz idéntica acoplada al conjunto de tubos de microcalibre para la aspiración de reactivos a las salidas.

Los tubos de microcalibre para la aspiración se sacaron de la incubadora y se colocaron en un conjunto de tubos cónicos de 15 ml de un solo uso (Falcon) para la recolección de medios acondicionados (Fig. 2(3)). Cada depósito de recolección se tapó con un tapón de goma (McMaster) que contenía dos orificios perforados de 0,06". Para cada tapón, el tubo de microcalibre que obtenía los medios acondicionados del chip microfluídico se insertó en un orificio y un tubo de microcalibre seco para las rutas de operación neumática de regreso a el cabezal de la válvula de distribución de aspiración se insertó en el otro orificio. La bomba de jeringa se usó para generar presión negativa en cada depósito de recolección en serie para extraer los medios acondicionados del chip de microfluidos al depósito de recolección. La separación entre el tubo neumático y el tubo de medios acondicionados atrapado la entrada de medios en el depósito de recogida.Todos los tubos microbore fueron sellados herméticamente a la válvula de distribución y la bomba de jeringa con tuerca de PTFE y adaptadores roscados de férula.

La bomba de jeringa y las válvulas de distribución se conectaron utilizando la configuración de cableado eléctrico multibomba descrita en el manual de Tecan. Un módulo de cómputo (Raspberry Pi 4) transmitió comunicaciones seriales con el protocolo de comunicación OEM Tecan usando una placa de expansión serial GPIO TX/RX a DB9M RS232 para Raspberry Pi (Ableconn). El módulo de cómputo de Raspberry Pi usó una pantalla táctil de 7" para editar y ejecutar protocolos. Se usó una interfaz de programa de aplicación (API) Python de código abierto para desarrollar el software necesario para llevar a cabo los protocolos en automatización29.

Los microfluidos basados ​​en PDMS se construyeron utilizando un molde de plástico impreso en 3D entrelazado (Fig. 4). Estos fueron impresos con una impresora SLA (Formlabs Form 3) con resina Model V2. Los moldes impresos se postprocesaron con sonicación en isopropanol (IPA) durante 20 min para eliminar el exceso de resina, seguido de secado en N2. Los componentes secos se curaron con luz ultravioleta (405 nm) durante 30 min a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Como se ilustra en la Fig. 3, las partes del molde se ensamblaron y llenaron con PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) preparado mezclando prepolímero de PDMS y un agente de curado (10:1 p/p). Después de llenar el molde, el PDMS se desgasificó en una cámara de vacío durante 1 hora. El molde lleno de PDMS se deja curar durante 24 h a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) antes de retirar el PDMS del molde.

Los sustratos de vidrio de borosilicato (\(101,6\hbox {mm} \times 127,0\hbox {mm}\), McMaster-Carr) se limpiaron mediante sonicación en acetona (10 min), luego alcohol isopropílico (10 min) y se secaron con N2 . El sustrato de vidrio y la superficie de PDMS moldeada se activaron con plasma de oxígeno a 50 W durante 45 s. El vidrio y el PDMS (Fig. 4C) se alinearon a mano, se presionaron juntos y se hornearon a \(100\,^{\circ }\hbox {C}\) en una placa caliente durante 30 min, formando un sello irreversible.

Se depositó una capa de 10 \(\upmu \hbox {m}\) de parileno-C (Specialty Coating Systems) en el chip de microfluidos para evitar la absorción de moléculas pequeñas por PDMS. Se cargaron dos gotas de silano A-174 (Sigma-Aldrich) en la cámara de deposición para promover la adhesión.

La placa de interfaz fluídica (Fig. 4F) se imprimió en 3D para conectar el tubo de microcalibre de 2,2 mm de diámetro exterior (Cole-Palmer) con las características de entrada y salida del PDMS. Cada geometría de conector constaba de 24 extrusiones cilíndricas con un diámetro exterior de 2,7 mm y un diámetro interior de 2,2 mm. Dentro de cada orificio había tres púas de 0,2 mm de largo para sujetar el tubo de microcalibre cuando se insertaba. Este componente se imprimió con una impresora Formlabs SLA (Form 2) con resina Surgical Guide con sonicación en isopropanol (IPA) durante 20 min para eliminar el exceso de resina, seguido de secado en N2. A continuación, los componentes secos se curaron con luz ultravioleta (405 nm) durante 30 min a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Para garantizar la biocompatibilidad, la pieza se recubrió con 5 \(\upmu \hbox {m}\) de parileno-C (Specialty Coating Systems). También se cargaron dos gotas de silano A-174 (Sigma-Aldrich) en la cámara de deposición con el dispositivo para promover la adhesión.

La esterilización de la bomba de la jeringa, los cabezales de las válvulas, los tubos, las placas de interfaz fluídica y las tapas de los tubos de recolección se llevó a cabo según la recomendación del proveedor (Tecan). Se empujó un lavado de 10 minutos con etanol al 70 % procedente de un depósito de vidrio esterilizado en autoclave a través de la plataforma hasta los depósitos de recogida a través de la bomba de jeringa. Después de etanol al 70 %, se aplicó un ciclo de secado de aire estéril procedente de un filtro de 0,22 \(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) durante 10 minutos. Se realizaron diez ciclos posteriores de agua desionizada, libre de núcleos y secado bajo los mismos parámetros. El chip de microfluidos y los depósitos de medios se esterilizaron en autoclave a \(121^{\circ }\hbox {C}\) durante 45 min y se secaron durante 15 min inmediatamente antes de su uso. Todos los componentes se transfirieron a través de bolsas autoclavables selladas a un gabinete de bioseguridad en cultivo de tejidos para la carga de organoides y medios. Los medios suplementados preparados previamente se transfirieron a cada depósito de medios y se taparon (VapLock) y luego se almacenaron en refrigeración durante la duración del experimento.

La línea de células madre embrionarias humanas H9 (WiCell, autenticada en la fuente) se cultivó en placas de cultivo celular recubiertas de vitronectina humana recombinante (Thermo) en StemFlex Medium (Gibco). El subcultivo se realizó incubando las placas con EDTA 0,5 mM durante 5 min y luego se resuspendieron en medio de cultivo para transferirlas a nuevas placas recubiertas.

Para generar organoides cerebrales, los cultivos adherentes se disociaron en células individuales utilizando el reactivo de disociación celular Accutase (Gibco) y luego se agregaron en placas AggreWell 800 de 24 pocillos (STEMCELL Technologies) a una densidad de 3 000 000 de células por pocillo con 2 ml de medio AggreWell (STEMCELL Technologies). ) complementado con Rho Kinase Inhibitor (Y-27632, 10 \(\upmu \hbox {M}\), Tocris, 1254) (día 0). Al día siguiente (día 1), se reemplazó manualmente 1 ml del medio AggreWell con medio suplementado que contenía inhibidor de WNT (IWR1-\(\varepsilon\), 3 \(\upmu \hbox {M}\), Cayman Chemical, 13659, días 1-10) e inhibidor de Nodal/Activin (SB431542, Tocris, 1614, 5 \(\upmu \hbox {M}\), días 1-10). El día 2, los agregados se transfirieron a un filtro de 37 \(\upmu \hbox {m}\) (STEMCELL Technologies) aspirando cuidadosamente con una pipeta de calibre ancho p1000 fuera de la placa AggreWell. Los organoides se transfirieron a placas de 6 pocillos de adhesión ultrabaja (Corning) mediante inversión y lavado de los filtros con medio AggreWell fresco. Los medios se cambiaron los días 3, 4, 5, 6, 8 y 10 reemplazando manualmente 2 ml de medios acondicionados con medios nuevos. A partir del día 11, el medio se cambió a medio de diferenciación neuronal que contenía medio Eagle: mezcla de nutrientes F-12 con suplemento GlutaMAX (DMEM/F12, Thermo Fisher Scientific, 10565018), suplemento 1X N-2 (Thermo Fisher Scientific, 17502048) , concentrado de lípidos químicamente definidos 1X (Thermo Fisher Scientific, 11905031) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina suplementados con factor de crecimiento de fibroblastos b humano recombinante al 0,1 % (Alamone F-170) y factor de crecimiento epidérmico humano recombinante al 0,1 % (sistemas de I+D 236 -P.EJ).

Los organoides de "suspensión" del grupo de control permanecieron suspendidos en placas de 6 pocillos y se mantuvieron con cambios de medio de 2 ml cada dos días durante el resto del cultivo. Los organoides "automatizados" del grupo experimental se cargaron en el chip de microfluidos y experimentaron cambios en los medios de 70 \(\upmu \hbox {L}\) una vez cada hora durante el resto del cultivo.

El día 12 de la diferenciación del organoide cerebral, se preparó el chip de microfluidos pipeteando 50 \(\upmu \hbox {L}\) de Matrigel enfriado (aproximadamente \(0\,^{\circ }\hbox {C}\)) hESC Qualif Matrix (BD 354277) en cada pocillo. Inmediatamente después de Matrigel, los organoides cerebrales individuales se transfirieron a través de una pipeta de calibre ancho p1000 con 70 \(\upmu \hbox {L}\) de medios acondicionados nativos a cada pocillo y se colocaron en el centro del pocillo para obtener imágenes. El chip se cubrió con una tapa de placa de 24 pocillos y se incubó a \(37^{\circ }\hbox {C}\) durante 15 minutos para fijar el Matrigel. Cada pocillo se llenó con 70 \(\upmu \hbox {L}\) adicionales de medio fresco y se conectó a placas de interfaz fluídica (Fig. 4F) enrutadas hacia la incubadora a través de un puerto de acceso trasero. Las placas de interfaz fluídica se ajustaron manualmente a presión en el chip microfluídico y el chip se colocó en la plataforma de imágenes (si corresponde).

Se utilizó el protocolo Smart-seq236 para generar bibliotecas de secuenciación de cDNA de longitud completa a partir de mRNA de organoides completos. Brevemente, los organoides completos se lisaron usando tampón de lisis para producir lisado celular que contenía ARNm poliadenilados que se transcribieron inversamente con Superscript III (ThermoFisher Scientific) usando un cebador oligoDT (/5Me-isodC/AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN) y el cambio de plantilla se realizó con un cambio de plantilla oligo (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG). El cebador oligoDT y las oligosecuencias de cambio de plantilla sirvieron como sitios de cebador para la amplificación de ADNc aguas abajo (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT). El ADNc se cuantificó mediante un ensayo fluorométrico de alta sensibilidad de ADN Qubit 3.0 y la calidad se evaluó mediante un kit bioanalizador de ADN de alta sensibilidad (Agilent). Se usó la transposasa HT de Nextera (Illumina) para convertir 1 ng de ADNc en bibliotecas de secuenciación con código de barras.

Las lecturas de extremos emparejados se secuenciaron a 75 × 75 pb en un Illumina NextSeq 550, y la profundidad adicional se secuenció a 50x50 pb en un Illumina NovaSeq 6000 hasta una profundidad de lectura promedio de 65 millones de lecturas emparejadas por muestra. Las muestras se desmultiplexaron usando códigos de barras Illumina i5 e i7, y las muestras de mayor profundidad se submuestrearon a 100M usando SAMtools37. Las lecturas recortadas se combinaron y alinearon con el genoma humano (ensamblaje hg38 UCSC) con alineación STAR38 (Gencode v37) usando la canalización toil-rnaseq39. Los parámetros de STAR provienen de la canalización DCC de ENCODE40. La expresión génica diferencial se realizó utilizando el paquete DESeq241 en RStudio. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes se realizó utilizando g: Profiler42.

Los organoides cerebrales se recolectaron, se fijaron en paraformaldehído al 4% (ThermoFisher Scientific #28908), se lavaron con PBS 1X y se sumergieron en una solución de sacarosa al 30% (Millipore Sigma #S8501) en PBS hasta saturación. Las muestras se incrustaron en criomoldes (Sakura - Tissue-Tek Cryomold) que contenían medio de congelación de tejido (Datos generales, TFM-C), se congelaron y almacenaron en −\(80\,^{\circ }\hbox {C}\). Los organoides se seccionaron con un criostato (Leica Biosystems #CM3050) a 18 \(\upmu \hbox {M}\) sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones de organoides se lavaron tres veces durante 10 min en PBS 1X antes de una incubación de dos horas en BSA al 10 % en solución de bloqueo de PBS (ThermoFisher Scientific #BP1605-100). Luego, las secciones se incubaron en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a \(4^{\circ }\hbox {C}\). Al día siguiente, las secciones se lavaron tres veces con PBS 1X durante 30 min. Luego se incubaron en una solución de anticuerpos secundarios diluidos en una solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h. Las secciones se lavaron tres veces más en PBS 1X durante 30 min.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron: conejo anti SOX2 (ab97959, dilución 1:250), pollo anti Nestin (ab134017, dilución 1:250) y DAPI (Sigma D9542-10 mg). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: cabra anti-conejo Alexa Fluor 594 (ab150080, dilución 1:250) y cabra anti-pollo Alexa Fluor 488 (ab150169, dilución 1:250). Las imágenes se realizaron utilizando el microscopio de campo amplio Zeiss Axioimager Z2 en el Instituto de Biología de Células Madre de UC Santa Cruz (RRID: SCR_021135) y el software Zen Pro. Las imágenes fueron procesadas utilizando ImageJ.

La dinámica de fluidos de llenado y drenaje de los pozos se predijo utilizando un software comercial de dinámica de fluidos computacional COMSOL®Multiphysics 5.5 (Estocolmo, Suecia). La Figura 5B muestra los primeros 2 s del ciclo de llenado (\(70\, {\upmu }\hbox {L}\) de medios entregados con una velocidad promedio de \(9.85 \times 10^4\,\hbox {m /s}\)). El pozo tiene una profundidad de \(5\,\hbox {mm}\) y un diámetro de \(5.6\,\hbox {mm}\). En esta simulación, las propiedades del medio fueron \(997\,\hbox {kg/m}^3\) densidad y \(6,92 \times 10^3\,\hbox {kg/ms}\) viscosidad. La simulación predice el límite de fase (entre líquido y aire) como una superficie libre43. El dominio de la solución consta de una pared rígida (el pozo) con condiciones de contorno "antideslizamiento" y la superficie superior (la interfaz aire-medio) abierta a la incubadora con condiciones de contorno "deslizamiento". El organoide se simuló como una geometría de esfera fantasma con un diámetro de \(1.8\,\hbox {mm}\). Las condiciones atmosféricas se establecieron en una presión de \(1\,\hbox {atm}\), una temperatura de \(37\,^{\circ }\hbox {C}\), y una composición de gas de \(5 \%\) dióxido de carbono, \(17\%\) oxígeno y \(78\%\) nitrógeno. Visualizamos el campo de velocidad en la sección transversal vertical central del pozo usando líneas de flecha de flujo. La simulación utilizó un total de 519.830 elementos tetraédricos.

Los datos de secuenciación de ARN poliadenilado se han depositado en GSE207894. Los datos adicionales de expresión diferencial que originaron la Fig. 7A están disponibles en las Tablas complementarias 1–4.

Gey, GO, Coffman, WD & Kubicek, MT Estudios de cultivo de tejidos de la capacidad proliferativa del carcinoma cervical y el epitelio normal. Cáncer Res. 12, 264–265 (1952).

Google Académico

Scherer, WF, Syverton, JT & Gey, GO Estudios sobre la propagación in vitro de virus de la poliomielitis. IV. Multiplicación viral en una cepa estable de células epiteliales malignas humanas (cepa hela) derivadas de un carcinoma epidermoide del cuello uterino. Exp. Medicina. 97, 695–710 (1953).

Artículo CAS Google Académico

Ringe, J., Kaps, C., Burmester, G.-R. & Sittinger, M. Células madre para la medicina regenerativa: Avances en la ingeniería de tejidos y órganos. Naturwissenschaften 89, 338–351 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Patel, M. & Yang, S. Avances en la reprogramación de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas. Stem Cell Rev. Rep. 6, 367–380 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rossi, G., Manfrin, A. & Lutolf, MP Progreso y potencial en la investigación de organoides. Nat. Rev. Genet. 19, 671–687 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hofer, M. & Lutolf, MP Ingeniería de organoides. Nat. Rev.Mater. 6, 402–420 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lancaster, MA & Huch, M. Modelado de enfermedades en organoides humanos. Dis. Modelos Mec. 12, dmm039347 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Qian, X., Song, H. y Ming, G.-L. Organoides cerebrales: avances, aplicaciones y retos. Desarrollo 146, dev166074 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marton, RM & Paşca, SP Tecnologías de organoide y ensambleide para investigar la diafonía celular en el desarrollo y la enfermedad del cerebro humano. Tendencias Cell Biol. 30, 133–143 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Renner, M. et al. Patrones de desarrollo autoorganizados y diferenciación en organoides cerebrales. EMBO J. 36, 1316–1329 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kanton, S. et al. El atlas genómico unicelular de organoide descubre características específicas del desarrollo cerebral humano. Naturaleza 574, 418–422 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Nascimento, JM et al. Los organoides cerebrales humanos y el tejido cerebral fetal comparten similitudes proteómicas. Frente. Desarrollo celular Biol. 7, 303 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kadoshima, T. et al. Autoorganización de la polaridad axial, el patrón de capas de adentro hacia afuera y la dinámica de progenitores específicos de la especie en la neocorteza humana derivada de células ES. proc. nacional Academia ciencia 110, 20284–20289 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lancaster, MA et al. Los organoides cerebrales modelan el desarrollo del cerebro humano y la microcefalia. Naturaleza 501, 373–379 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Neal, JT et al. Modelado organoide del microambiente inmune tumoral. Celda 175, 1972–1988 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giandomenico, SL, Sutcliffe, M. & Lancaster, MA Generación y cultivo a largo plazo de organoides cerebrales avanzados para el estudio de etapas posteriores del desarrollo neural. Nat. Protocolo 16, 579–602 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Polen, AA et al. Establecimiento de organoides cerebrales como modelos de evolución cerebral específica humana. Celda 176, 743–756 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Campo, AR et al. Los LncRNA de primates estructuralmente conservados se expresan transitoriamente durante la diferenciación cortical humana e influyen en los genes específicos del tipo de célula. Representante de células madre 12, 245–257 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Bhaduri, A. et al. El estrés celular en los organoides corticales perjudica la especificación del subtipo molecular. Naturaleza 578, 142–148 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uzquiano, A. et al. El atlas multiómico unicelular del desarrollo de organoides descubre programas moleculares longitudinales de diversificación celular de la corteza cerebral humana. bioRxivhttps://doi.org/10.1101/2022.03.17.484798 (2022).

Artículo Google Académico

Nguyen, N.-T., Majid Hejazian, CHO & Kashaninejad, N. Avances recientes y perspectivas futuras en el manejo de líquidos microfluídicos. Micromáquinas 8, 186 (2017).

Artículo PubMed Central Google Académico

Tenje, M., Fornell, A., Ohlin, M. y Nilsson, J. Métodos de manipulación de partículas en microfluidos de gotas. Anal. química 90, 1434–1443 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chokkalingam, V. et al. Sondeo de la heterogeneidad celular en células inmunitarias secretoras de citocinas mediante microfluidos basados ​​en gotitas. Ficha de laboratorio 13, 4740–4744 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Paoli, R. et al. Fabricación rápida de dispositivos microfluídicos multicapa para aplicaciones de órganos en un chip. Sensores 21, 1382 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong, F., Yuan, L., Zheng, YF y Chen, W. Manejo automático de líquidos para las ciencias de la vida: una revisión crítica del estado actual del arte. Laboratorio J. automático 17, 169–185 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shirure, VS et al. Plataforma de tumor en un chip para investigar la progresión y la sensibilidad a los fármacos en líneas celulares y organoides derivados de pacientes. Ficha de laboratorio 18, 3687–3702 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, YS et al. Plataforma de órganos en chips integrados con sensores múltiples para el monitoreo in situ automatizado y continuo de los comportamientos de los organoides. proc. nacional Academia ciencia 114, E2293–E2302 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Parques, DF et al. Arquitectura de Internet de las cosas para biología de alto rendimiento. bioRxivhttps://doi.org/10.1101/2021.07.29.453595 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Pruitt, B. y Conway, N. tecancavro. https://github.com/benpruitt/tecancavro (2015).

Salek, MM, Sattari, P. y Martinuzzi, RJ Análisis del flujo de fluidos y patrones de tensión de cizallamiento de la pared dentro de placas de pozos de cultivo agitados parcialmente llenos. Ana. biomedicina Ing. 40, 707–728 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Goto-Silva, L. et al. Análisis dinámico de fluidos computacional de las fuerzas físicas que desempeñan un papel en cultivos de organoides cerebrales en dos plataformas multiplex diferentes. Desarrollo BMC Biol. 19, 1–10 (2019).

Artículo Google Académico

Suong, ADN et al. Inducción de morfología invertida en organoides cerebrales mediante biorreactores de mezcla vertical. común Biol. 4, 1–13 (2021).

Artículo Google Académico

COMSOL. Introducción a comsol multifísica®. COMSOL Multiphysics, Burlington, MA, consultado el 9 de febrero de 2018 (1998).

Ly, VT et al. Picroscopio: sistema de bajo costo para imágenes biológicas longitudinales simultáneas. común Biol. 4, 1–11 (2021).

Artículo Google Académico

Baudin, PV et al. Microscopía remota basada en la nube de bajo costo para ciencias biológicas. Internet de las cosas 18, 100454 (2022).

Artículo Google Académico

Picelli, S. et al. RNA-seq de longitud completa de células individuales usando Smart-seq2. Nat. Protocolo 9, 171–181 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, H. et al. La alineación de secuencias/formato de mapa y samtools. Bioinformática 25, 2078–2079 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dobin, A. et al. Star: Alineador ultrarrápido RNA-seq universal. Bioinformática 29, 15–21 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vivian, J. et al. El trabajo duro permite realizar análisis de datos biomédicos grandes, reproducibles y de código abierto. Nat. Biotecnología. 35, 314–316 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin , A. , Hitz , B. & Dewey , C. Canalización de procesamiento de secuencias largas de ARN codificadas basadas en estrellas . https://github.com/ENCODE-DCC/long-rna-seq-pipeline (2016).

Stewart, LJ y col. Papel del glutatión en la amortiguación del exceso de cobre intracelular en Streptococcus pyogenes. mBio 11, e02804-20 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reimand, J., Kull, M., Peterson, H., Hansen, J. y Vilo, J. g: Profiler: un conjunto de herramientas basado en la web para la elaboración de perfiles funcionales de listas de genes de experimentos a gran escala. Ácidos Nucleicos Res. 35, W193–W200 (2007).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Osher, S. & Fedkiw, R. Métodos de conjuntos de niveles y superficies implícitas dinámicas. aplicación Matemáticas. ciencia 44, 685 (2002).

Matemáticas Google Académico

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por Schmidt Futures SF 857 y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano bajo el Premio número 1RM1HG011543 (DH, SRS y MT), el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R01MH120295 (SRS) Defense Advanced Agencia de Proyectos de Investigación (DARPA), Oficina de Investigación del Ejército, bajo el Acuerdo de Cooperación No. W911NF-18-2-0104, y el Departamento del Interior, Premio No. D20AC00003. (MR y MT), la National Science Foundation con el número de adjudicación NSF 2034037 (REG, SRS y MT) y NSF 2134955 (MT, SRS y DH). DH es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Los autores quieren dar un agradecimiento especial a Pattawong Pansodtee, David Parks, Matt Elliott por las discusiones y al Centro de cultivo celular de IBSC (RRID:SCR 021353), y al Centro de microscopía de ciencias biológicas de UCSC (RRID:SCR 021135) por sus valiosos recursos y asistencia. .

UC Santa Cruz Genomics Institute, University of California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, USA

Spencer T. Seiler, Gary L. Mantalas, Sebastian Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Liam Tran, Ryan N. Hoffman, Marco Rolandi, Richard E. Green, David Haussler, Sophie R. Salama y Mircea Teodorescu

Departamento de Ingeniería Biomolecular, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Spencer T. Seiler, Liam Tran, Richard E. Green y David Haussler

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Gary L. Blankets, Ryan N. Hoffman y Sophie R. Salama

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

John Selberg, Sergio Lamb, Sebastián Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Finn Amend, Marco Rolandi & Mircea Theodorescu

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

david haussler

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

STS, JS, SC y FA desarrollaron la plataforma de cultivo celular microfluídico automatizado. GLM y RNH proporcionaron cultivos celulares. STS y GLM realizaron los experimentos y el análisis del transcriptoma. STM desarrolló la simulación de dinámica de fluidos computacional PVB y VTL realizó la adquisición y el análisis de imágenes. LT y RNH realizaron tinción inmunohistoquímica. STS generó las fotos y los dibujos de las figuras. MR, DH, SRS, REG y MT supervisaron el equipo y aseguraron la financiación. Todos los autores contribuyeron a escribir el manuscrito.

Correspondencia a Sofie R. Salama o Mircea Teodorescu.

STS y GLM son fundadores de OrganOmics, una empresa que puede verse afectada por la investigación que se informa en el documento adjunto. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Seiler, ST, Mantalas, GL, Selberg, J. et al. La plataforma modular automatizada de cultivo de células microfluídicas reduce el estrés glucolítico en los organoides de la corteza cerebral. Informe científico 12, 20173 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

Descargar cita

Recibido: 12 julio 2022

Aceptado: 08 septiembre 2022

Publicado: 23 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Revista de Nanobiotecnología (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.